GB 4789.4-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验

前言
本标准代替 GB/T 4789.4-2008《食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验》。
本标准与 GB/T 4789.4-2008 相比，主要变化如下
——修改了标准的中英文名称；
——修改了标准的范围；
——修改了培养基和试剂；
——修改了设备和材料；
——修改了附录 A。
本标准的附录 A、附录 B 为规范性附录。
本标准所代替的历次版本发布情况为：
——GB 4789.4-84、GB 4789.4-1994、GB/T 4789.4-2003、GB/T 4789.4-2008。

食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中沙门氏菌（Salmonella）的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
2.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.2 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。
2.3 均质器。
2.4 振荡器。
2.5 电子天平：感量 0.1 g。
2.6 无菌锥形瓶:容量 500 mL，250 mL。
2.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.8 无菌培养皿：直径 90 mm。
2.9 无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。
2.10 无菌毛细管
2.11 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。
2.12 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）： 见附录 A 中 A.1。
3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录 A 中 A.2。
3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录 A 中 A.3。
3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录 A 中 A.4。
3.5 HE 琼脂：见附录 A 中 A.5。
3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录 A 中 A.6
3.7 沙门氏菌属显色培养基。
3.8 三糖铁（TSI）琼脂：见附录 A 中 A.7。
3.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A 中 A.8。
3.10 尿素琼脂（pH 7.2）：见附录 A 中 A.9。
3.11 氰化钾 （KCN） 培养基：见附录 A 中 A.10。
3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录 A 中 A.11。
3.13 糖发酵管：见附录 A 中 A.12。
3.14 邻硝基酚-D 半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录 A 中 A.13。
3.15 半固体琼脂：见附录 A 中 A.14。
3.16 丙二酸钠培养基：见附录 A 中 A.15。
3.17 沙门氏菌 O 和 H 诊断血清。
3.18 生化鉴定试剂盒。

4 检验程序
沙门氏菌检验程序见图 1。

图 1 沙门氏菌检验程序

5 操作步骤
5.1 前增菌
称取 25 g（mL）样品放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中，以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质 1 min～2 min，或置于盛有 225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。若样 品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定 pH 值，用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调 pH 至 6.8±0.2。
无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于 36 ℃±1 ℃培养 8 h～ 18h。
如为冷冻产品,应在 45 ℃以下不超过 15 min,或 2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻。
5.2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于 10 mL TTB 内，于 42 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。
5.3 分离
分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板（或 HE 琼脂 平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于 36 ℃±1 ℃分别培养 18 h～24 h （XLD 琼脂平板、HE 琼脂 平板、沙门氏菌属显色培养基平板） 或 40 h～48 h （BS 琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落, 各个平板上的菌落特征见表 1。
表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

5.4 生化试验
5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 ℃±1 ℃ 培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属 的反应结果见表 2。

表 2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性。
5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 （供做靛基质试 验）、尿素琼脂 （pH7.2）、氰化钾 （KCN） 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑 取可疑菌落接种。于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h，按表 3 判定结果。将已挑菌 落的平板储存于 2 ℃～5 ℃或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。

表 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。
5.4.2.1 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1 项异常，按表 4 可判定为沙门氏菌。 如有 2 项异常为非沙门氏菌。

表 4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

注：＋表示阳性；＋表示阴性

5.4.2.2 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
5.4.2.3 反应序号 A3：补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒 沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
5.4.2.4 必要时按表 5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。
表 5 沙门氏菌属各生化群的鉴别

注：＋表示阳性; －表示阴性。

5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据 5.4.1 的初步判断结果，从营 养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动 微生物生化鉴定系统进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1 抗原的准备
一般采用 1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 （如 2％～3％） 培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在 0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落 蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有 0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管 1 次～2次，自远端取菌培养后再检查。
5.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定
在玻片上划出 2 个约 1 cm×2 cm 的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上 部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对 照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对 着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
5.5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定
同 5.5.2。
5.5.4 血清学分型（选做项目）
5.5.4.1 O 抗原的鉴定
用 A～F 多价 O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形 菌株，不能分型。
被 A～F 多价 O 血清凝集者，依次用 O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2 和 O11 因子血清做凝集 试验。根据试验结果，判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株，再用 O10、O15、O34、O19 单因 子血清做凝集试验，判定 E1、E2、E3、E4 各亚群，每一个 O 抗原成分的最后确定均应根据 O 单因 子血清的检查结果，没有 O 单因子血清的要用两个 O 复合因子血清进行核对。
不被 A～F 多价 O 血清凝集者，先用 9 种多价 O 血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种 血清所包括的 O 群血清逐一检查，以确定 O 群。每种多价 O 血清所包括的 O 因子如下：
O 多价 1 A，B，C，D，E，F，群 （并包括 6,14 群）
O 多价 2 13，16，17，18，21 群
O 多价 3 28，30，35，38，39 群
O 多价 4 40，41，42，43 群
O 多价 5 44，45，47，48 群
O 多价 6 50，51，52，53 群
O 多价 7 55，56，57，58 群
O 多价 8 59，60，61，62 群
O 多价 9 63，65，66，67 群
5.5.4.2 H 抗原的鉴定
属于 A～F 各 O 群的常见菌型，依次用表 6 所述 H 因子血清检查第 1 相和第 2 相的 H 抗原。
表 6 A～F 群常见菌型 H 抗原表

不常见的菌型，先用 8 种多价 H 血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种 血清所包括的各种 H 因子血清逐一检查，以第 1 相和第 2 项的 H 抗原。8 种多价 H 血清所包括的 H 因子如下：

H多价1 a，b，c，d，i
H多价2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51
H多价3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40
H多价4 1,2；1,5；1,6；1,7；z6
H多价5 z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38
H多价6 z39，z41，z42，z44
H多价7 z52，z53，z54，z55
H多价8 z56，z57，z60，z61，z62

每一个 H 抗原成分的最后确定均应根据 H 单因子血清的检查结果，没有 H 单因子血清的要用两 个 H 复合因子血清进行核对。
检出第 1 相 H 抗原而未检出第 2 相 H 抗原的或检出第 2 相 H 抗原而未检出第 1 相 H 抗原的,可 在琼脂斜面上移种 1～2 代后再检查。如仍只检出一个相的 H 抗原，要用位相变异的方法检查其另一 个相。单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如下：
小玻管法： 将半固体管（每管约 1 mL～2 mL） 在酒精灯上溶化并冷至 50 ℃，取已知相的 H 因子血清 0.05 mL～0.1 mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试 验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁 放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端 挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细 菌的动力不能抑制。一般按原血清 1：200～1：800 的量加入。
小倒管法：将两端开口的小玻管 （下端开口要留一个缺口，不要平齐） 放在半固体管内,小玻 管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至 50 ℃，挑取因子 血清 1 环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管 中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或 转种 1％软琼脂斜面，于 37 ℃培养后再做凝集试验。
简易平板法：将 0.35％～0.4％半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清 1 环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓 延生长的菌苔边缘取菌检查。
5.5.4.3 Vi 抗原的鉴定
用 Vi 因子血清检查。已知具有 Vi 抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林 沙门氏菌。
5.5.4.4 菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果，按照附录 A 或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
6 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。